Статья подготовлена химиком,
генетиком Еленой Николаевной Кириченко
В июле 2020 г. вышла статья «Self-amplifying RNA SARS-CoV-2 lipid nanoparticle vaccine candidate induces high neutralizing antibody titers in mice» [1], в которой исследователи из Англии и Канады опубликовали данные доклинических исследований новой РНК вакцины против SARS-CoV-2.
Эта вакцина представляет собой РНК, кодирующую спайковый белок вируса SARS-CoV-2, инкапсулированную в липидную наночастицу (LNP). Авторы сообщают: «Мы наблюдаем удивительно высокие и дозозависимые титры антител, специфичных к SARS-CoV-2, в сыворотке крови мышей, а также надежную нейтрализацию как псевдовируса, так и вируса дикого типа.
Мы не наблюдали какое-либо антителозависимое усиление (ADE) SARSCoV-2 в наших исследованиях in vitro, как это наблюдалось для SARS и MERS [2, 3], но роль этого явления в формировании вакцино-индуцированного иммунитета еще до конца не изучена. Иммунизация saRNA LNP вызывает у мышей Th1-смещенный ответ, и наблюдается продуцирование интерферона-гамма (IFN-γ), при повторной стимуляции пептидами SARS-CoV-2».
Такие многообещающие заявления были основаны на результатах 3-х экспериментов, описанных ниже. Эксперименты были выстроены следующим образом: первый должен был проверить, проникается ли вирус в клетку с помощью антител; второй – как дегенеративные изменения в клеточных линиях, вероятно, связанные с размножением вируса, зависят от концентрации антител; и третий – определение типа иммунного ответа.
1) Анализ нейтрализации псевдотипа вируса:
Псевдотип вируса – это некая модельная частица, которая создана искусственно и используется для имитации вируса дикого типа. Использование различных псевдовирусных частиц широко распространено для построения модельных экспериментов, однако следует помнить, что это – только модель. Результаты, полученные с помощью таких моделей, не всегда будут отражать абсолютную реальность, также, как и в случае при сопоставлении результатов in vitro и in vivo.
В данном случае псевдотип был получен введением в клетки HEK293: плазмиды gag-pol ВИЧ-1; плазмиды, несущей люциферазу светлячков; и плазмиды, кодирующей S-белок (в соотношении 1: 1,5: 1). Среду, содержащую псевдотип вируса, осветляли центрифугированием и фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм спустя 72 часа после трансфекции, полученный псевдотип хранили при температуре −80 ° С.
Далее сыворотку крови вакцинированных мышей или сыворотку крови пациентов, переболевших COVID-19, инкубировали в течение 1 часа с предварительно полученной смесью, содержащей псевдовирусные частицы.
После чего смесь псевдовирус-сыворотка переносили в лунки с клетками Сасо-2, через 48 часов клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с помощью анализатора Bright-Glo (Promega). IC50 нейтрализации рассчитывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 8.4).
«Мы проанализировали кривые титрования данных нейтрализации псевдовирусов, ища любое антитело-зависимое усиление (ADE) инфекции».
Основная идея этого метода, вероятно, заключалась в следующем: при конструировании псевдовируса люцифераза использовалась как репортер, т.е. была предпринята попытка отследить, будет ли комплекс антитело-псевдовирус проникать внутрь клетки. Люцифераза как сигнальная лампочка должна была показывать, где находится псевдовирус.
Здесь отмечу, что на основании результатов данного метода никак нельзя заявлять об отсутствии эффекта антителозависимого усиления, так как здесь речь идет только об одном из предполагаемых механизмов, а именно – усиленное инфицирование клеток за счет комплекса с Fc-рецепторами.
Кстати говоря, в этом эксперименте не был продемонстрирован эффект ADE и при работе с сывороткой крови пациентов, которым диагностировали COVID-19, тогда как этот эффект характерен для данного семейства вирусов. На графике приведены титры нейтрализации, при которых наблюдалось 50% уменьшения количества бляшек. Однако с учетом предположения о том, что ADE чаще возникает при низком титре антител, стоило бы протестировать более высокие разбавления.
Также не лишним было бы в качестве контрольного эксперимента воспроизвести эффект ADE для MERS или SARS-CoV-2 в тех же условиях.
2) Анализ нейтрализации вирусов дикого типа:
Аналогично предыдущему эксперименту клинические образцы, полученные от пациентов с диагнозом COVID-19, были инкубированы в течение 1 часа с сыворотками крови и затем перенесены на планшет в ячейки с клетками Vero-E6.
Планшеты инкубировали при 37 ° C, 5% CO2 в течение 5 дней перед добавлением равного объема красителя кристаллического фиолетового. Планшеты промывали, лунки оценивали на цитопатический эффект и титр нейтрализации, рассчитанный как обратная величина наибольшего разведения сыворотки, при котором произошла полная нейтрализация вируса.
Немного поясню: цитопатический эффект по определению представляет собой дегенеративное изменение в клетках, связанное с размножением вирусов. Тот факт, что цитопатический эффект в экспериментах in vitro будет снижаться при увеличении количества антител, является абсолютно ожидаемым результатом, так как антитела связывают вирус в любом случае. Однако по одним только результатам исследований на клеточных линиях преждевременно говорить о нейтрализации. По факту, на этом уровне нельзя отличить нейтрализацию вируса от комплексов антиген-антитело, которые приводят к иммунным отложениям. Кроме того, установлена зависимость между гуморальным (за счет антител) и клеточным иммунитетом: чем выше гуморальный, тем ниже клеточный. А именно клеточный иммунитет ассоциирован с природной врожденной защитой.
Отсюда не понятно, почему разработчики любых вакцин против новой коронавирусной инфекции делают упор на высокие титры антител. При этом в некоторых работах отмечено, что ADE предположительно вызывают низкие титры антител. Таким образом, используя подобные иммунопрофилактические препараты, мы в любом случае рискуем нарваться на ADE, так как долгосрочного иммунитета к этому семейству вирусов не существует, а титр антител со временем будет падать. Именно поэтому нам рекомендуют регулярную ревакцинацию, чтобы поддерживать высокий титр антител, что в свою очередь – рано или поздно – просто убьёт клеточный иммунитет. Проще говоря, это в любом случае будут аутоиммунные патологии: либо ADE (более быстрый и более вероятный результат), либо, в случае регулярной ревакцинации, иммунодефицит.
Таким образом, что касается второго эксперимента – он всего лишь доказывает выработку антител в крови испытуемых животных в ответ на введенную вакцину. Говорить об эффективности и отсутствии ADE на этом этапе преждевременно.
Также в этом исследовании использовались клинические образцы, полученные от пациентов, диагноз которым был выставлен на основании ПЦР теста, что, скорее всего, уже не дает никаких гарантий на достоверность полученных результатов.
Не было попытки выделить культивированный вирус и сравнить его с исходным, если таковой имеется.
Что касается использования клеточных линий, в описанных выше экспериментах брали: Сасо-2 (культура клеток колоноректальной аденокарциномы человека) и Vero-E6 (клеточная линия получена из эпителия почки африканской зеленой мартышки). Тогда как усиленное инфицирование за счет антител к SARS-CoV и MERS чаще наблюдалось на фагоцитах [4] и было опосредовано наличием Fc-рецепторов. Также стоит отметить, что клеточные линии Vero не экспрессируют Fc-рецестор (гамма), зато эта линия экспрессирует TMPRSS2, что делает ее чувствительной к инфекции SARS-CoV-2 [5].
Ранее в феврале 2020 г. вышла статья [6] с описанием одного из механизмов антителозависимого усиления, в которой на клеточных линиях было показано, что антитела Mersmab1 к MERS опосредуют непрямое связывание S-белков вирусной оболочки MERS с Fc-рецепторами клеток человека. Опосредованное антителами проникновение вируса внутрь человеческих клеток было продемонстрировано на псевдотипе вируса MERS (ретровирусы с S-белками), который был создан аналогично тому, как описано в первом эксперименте выше. Для своего исследования авторы использовали клетки HEK293T, экзогенно-экспрессирующие Fc-рецепторы: CD16A, CD32A и CD64A (FcγRIIIA, FcγRIIA, FcγRI, соответственно) и макрофаги. Использование псевдотипа вируса вместо дикой формы авторы объясняют тем, что хотели отделить этап вирусного проникновения в клетку от других этапов вирусного заражения. В контрольных экспериментах, т.е. в отсутствии антител, проникновение псевдотипа вируса в эти же клетки не наблюдалось. При этом было показано, что эти же антитела блокируют проникновение вируса в клетки, экспрессирующие DPP4 (трансмембранный рецептор связывания MERS, через который обычно и происходит инфицирование для этого штамма коронавируса).
Таким образом, антитела не защищают от заражения, а перенаправляют его.
Также было показано, что антитела связываются с той же областью вирусного S-белка, что и DPP4, стабилизируя при этом S-белки в той же конформации, необходимой для протеолитической активации, что и DPP4. Дополнительно авторы оценили влияние различных протеаз на проникновение вируса в клетки. Так, например, PPCi усиливает проникновение псевдовируса в клетки, экспрессирующие DPP4, в отсутствии антител, тогда как в присутствии антител, аналогичная картина наблюдается для клеток, экспрессирующих CD32A. Точно также ведет себя и протеаза TMPRSS2, которая, кстати, является рецептором для SARS-CoV-2 наряду с ACE2 [7, 8].
Таким образом, сопоставляя результаты работ [1] и [6], становится заметно лукавство при выборе клеточных линий в работе [1] для анализа нейтрализации вируса дикого типа в плане интерпретации этих результатов – заявление об отсутствии ADE после вакцинации.
Действительно, для установления снижения цитопатического эффекта при наличии антител часто используются клетки Vero. Но если авторы взялись за проверку наличия ADE, было бы интересно провести аналогичный эксперимент, но на клетках, экспрессирующих Fc-рецепторы.
3) Измерение цитокинов в спленоцитах
К спленоцитам мышей (иммунокомпетентные клетки селезенки) добавляли рекомбинантный белок SARS-CoV-2. Цитокиновый ответ в каждой лунке количественно определяли с помощью специального 25-plex ProcartaPlex Immunoassay (ThermoFisher Scientific, UK) на системе Bio-Plex 200 (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя.
Спленоциты вакцинированных мышей при повторной стимуляции S-белками демонстрировали повышенную секрецию IFN-γ, на основании чего авторы и заявили, что наблюдали смещение иммунного ответа в сторону Th1. Однако кроме интерферона-гамма наблюдалась также секреция интерлейкинов: IL-10, IL-12, IL-17a, IL-21, IL-4, IL-5, IL-6 и TNF-α. Из них: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 имеют прямое отношение к Th2 иммунному ответу.
Если авторы работы верят, что в предыдущем опыте в клинических образцах, полученных от пациентов с COVID-19, действительно находится вирус, почему измерение цитокинов они не провели в ответ на вирус, почему использовали рекомбинантные белки.
Помимо всего выше сказанного, авторы рассматриваемой статьи не потрудились хотя бы гипотетически предположить, за счет чего их чудо-вакцина оказалась лишена эффекта антитело зависимого усиления инфекции. При том, что этот эффект они полностью признают для других штаммов коронавируса, по крайней мере для SARS-CoV и MERS. А также отмечают, что роль этого явления в формировании вакцино-индуцированного иммунитета еще до конца не изучена. Кроме того, исследования относятся только к одному из возможных механизмов ADE. Второй предполагаемый механизм не был проверен вовсе.
Таким образом, заявление об отсутствии ADE преждевременно.
Единственным гарантированным способом удостовериться в наличии или отсутствии этого эффекта является вакцинация животных с последующим заражением. А для этого необходимо иметь в наличии выделенный патоген. Не менее важным экспериментом было бы измерение скорости коагуляции крови вакцинированных животным при добавлении антигена и сравнение результатов с данными по контрольной группе.
Также хочется отметить, что ADE – не единственная проблема при создании вакцин. Кроме антитело зависимого усиления инфекции выделяют: скорость мутации вируса и множество его геномных вариантов (что характерно для коронавирусов), иммунное уклонение (иммунная система хозяина больше не может распознавать и устранять патоген) и пр. [9].
Список литературы:
1. Paul F McKay, Kai Hu, Anna K Blakney, Karnyart Samnuan, Jonathan C Brown, Rebecca Penn, Jie Zhou, Clément R Bouton, Paul Rogers, Krunal Polra, Paulo J C Lin, Christopher Barbosa, Ying K Tam, Wendy S Barclay, Robin J Shattock. Self-amplifying RNA SARS-CoV-2 lipid nanoparticle vaccine candidate induces high neutralizing antibody titers in mice.Nat Commun. 2020 Jul 9;11(1):3523. doi: 10.1038/s41467-020-17409-9. [PMID: 32647131]
2. Jason A Tetro. Is COVID-19 receiving ADE from other coronaviruses? Microbes Infect. 2020 Mar;22(2):72-73. doi: 10.1016/j.micinf.2020.02.006. Epub 2020 Feb 22. [PMID: 32092539]
3. Sheng-Fan Wang, Sung-Pin Tseng, Chia-Hung Yen, Jyh-Yuan Yang, Ching-Han Tsao, Chun-Wei Shen, Kuan-Hsuan Chen, Fu-Tong Liu, Wu-Tse Liu, Yi-Ming Arthur Chen, Jason C Huang. Antibody-dependent SARS coronavirus infection is mediated by antibodies against spike proteins. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Aug 22;451(2):208-14. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.07.090. Epub 2014 Jul 26. [PMID: 25073113]
4. Anjeanette Roberts, Elaine W Lamirande, Leatrice Vogel, Jadon P Jackson, Christopher D Paddock, Jeannette Guarner, Sherif R Zaki, Timothy Sheahan, Ralph Baric, Kanta Subbarao. Animal models and vaccines for SARS-CoV infection. Virus Res. 2008 Apr;133(1):20-32. doi: 10.1016/j.virusres.2007.03.025. Epub 2007 May 11. [PMID: 17499378]
5. Lenny van Mechelen, Willem Luytjes, Cornelis A M de Haan, Oliver Wicht. RSV neutralization by palivizumab, but not by monoclonal antibodies targeting other epitopes, is augmented by Fc gamma receptors. Antiviral Res. 2016 Aug;132:1-5. doi: 10.1016/j.antiviral.2016.05.003. Epub 2016 May 13. [PMID: 27185625]
6. Yushun Wan, Jian Shang, Shihui Sun, Wanbo Tai, Jing Chen, Qibin Geng, Lei He, Yuehong Chen, Jianming Wu, Zhengli Shi, Yusen Zhou, Lanying Du, Fang Li. J Virol. 2020 Feb 14;94(5):e02015-19. [PMID: 31826992]
7. “Hou Y., Peng C., Yu M., Li Y., Han Z., Li F., Wang L.F., Shi Z. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) proteins of different bat species confer variable susceptibility to SARS-CoV entry. Arch Virol. 2010 Oct;155(10):1563–1569. [PMID: 20567988]
8. Shutoku Matsuyama, Naganori Nao, Kazuya Shirato, Miyuki Kawase, Shinji Saito, Ikuyo Takayama, Noriyo Nagata, Tsuyoshi Sekizuka, Hiroshi Katoh, Fumihiro Kato, Masafumi Sakata, Maino Tahara, Satoshi Kutsuna, Norio Ohmagari, Makoto Kuroda, Tadaki Suzuki, Tsutomu Kageyama, Makoto Takeda. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Mar 31;117(13):7001-7003. doi: 10.1073/pnas.2002589117. Epub 2020 Mar 12. [PMID: 32165541]
9. G W Wilkinson, L K Borysiewicz. Gene therapy and viral vaccination: the interface. Br Med Bull. 1995 Jan;51(1):205-16. doi: 10.1093/oxfordjournals.bmb.a072947. [PMID: 7767644]
